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一、如何搭配流式抗體熒光標(biāo)記？

    流式抗體熒光標(biāo)記搭配主要由3個因素決定的：流式細胞儀能檢測多少個通道、需要同時檢測檢測多少個指標(biāo)、廠家的抗體有多少種熒光標(biāo)記。如果流式細胞儀的通道越多，那么同一份樣本能同時做的表面/胞內(nèi)標(biāo)志就越多.

A、 如何根據(jù)流式細胞儀搭配流式抗體

流式細胞儀能檢測多少個通道是由有多少根激光決定的以及每根激光的功能決定的，所以首先需要注意兩點：

流式細胞儀有哪些激光。

不同型號的流式細胞儀的同樣的一個通道檢測熒光素的能力是不一樣的.

B、搭配熒光素原則

搭配流式熒光素有2個原則：每個通道只能選擇1種熒光素；各個通道之間的熒光素可以隨意搭配，但需注意的是，APC和PE-Cy5一起使用的話，上流式以后，容易導(dǎo)致補償過度。

C、如果檢測的指標(biāo)數(shù)目超過了流式細胞儀的通道，怎么辦？ 
如果需要做5個指標(biāo)，而流式細胞儀只能做4個通道，首先將指標(biāo)歸成2類，再將樣本分成2份，分別檢測。比如需要同時檢測CD3、CD4、CD8、IL-4和IFN-gamma，那么將樣本分成兩份，第1份加CD3、CD4、CD8和IL-4，而第2份加CD3、CD4、CD8和IFN-gamma。

二、同型對照（Isotypy Control）

1、為什么要用同型對照？ 
同型對照是使用與一抗相同種屬來源、相同亞型、相同劑量和相同的免疫球蛋白及亞型的免疫球蛋白，用于消除由于抗體非特異性與細胞結(jié)合而產(chǎn)生的背景染色。同型對照是真正意思上的陰性對照，它不但可以用來設(shè)定流式細胞儀的電壓，而且還可以幫忙省去昂貴與繁瑣的重組細胞因子競爭封閉步驟。在流式細胞儀上樣前，染色方式如下： 
樣本管：一抗＋樣本 
同型對照管：同型對照＋樣本

2、如何選擇同型對照？ 
一般選擇與一抗的成分*相同種屬來源、相同亞型和亞鏈、相同熒光標(biāo)記的抗體，比如抗人的CD56 APC標(biāo)記的抗體，貨號是555518,成份是Mouse IgG1,κ。那么它的同型對照應(yīng)該是APC標(biāo)記的Mouse IgG1,κ，貨號是555751。注意同型對照的成份跟它的名稱是相同的.如果是抗體的組合形式是純化的一抗＋熒光標(biāo)記的二抗，那么應(yīng)該選擇一抗的同型對照。比如CDw125的純化抗體，貨號是555901，成分是Mouse IgG1,κ。它的同型對照是純化的Mouse IgG1,κ，貨號是555746。它的二抗PE標(biāo)記的抗小鼠IgG1,貨號是550083。那么染色方式如下： 
樣本管：純化的CDw25＋PE標(biāo)記的抗Mouse IgG1 ＋樣本 
同型對照管：純化的同型對照＋PE標(biāo)記的抗Mouse IgG1＋樣本

如果沒有找到適合的同型對照，在保持來源相同、熒光標(biāo)記相同、免疫球蛋白類別相同條件下，那么優(yōu)先選擇的順序應(yīng)該是亞鏈不同--亞型不同--相同類 
別。比如，某種的抗體的來源是Mouse IgG2а,κ。如果在同型對照表里面找到不到*相同的同型對照，那么優(yōu)先選擇相同熒光標(biāo)記的Mouse IgG2а為同型對照。如果也沒有找到Mouse IgG2а，那么優(yōu)先選擇相同熒光標(biāo)記的Mouse IgG2b作為同型對照。如果zui后還是沒有找到Mouse IgG2b，那么選者相同熒光標(biāo)記的Mouse IgG2作為同型對照。

3、哪些人需要使用同型對照？ 
A 對流式不是非常熟悉的人。 
B 做胞內(nèi)流式人，比如胞內(nèi)細胞因子、趨化因子和信號蛋白等。 
C 使用不常見的標(biāo)志或者特異性不高的標(biāo)志的人，因為實驗者不熟悉不常見標(biāo)志的表達情況，根據(jù)同型對照可以判斷陽性細胞的位置。一些特異性不高的抗體，如多抗，非特異性結(jié)合非常多，使用同型對照可排除假陽性。 
D 對流式非常熟悉又使用常用的表面標(biāo)志的人一般可以不使用同型對照。

4、為什么有時候同型對照的表達會比抗體的表達高？ 
首先需要檢查同型對照的抗體是否加錯類型、劑量等。其次，因為有些標(biāo)志在細胞的表面或者胞內(nèi)表達不高，而跟其類似的抗原非常多，那么加入同型對照時，
同型對照非特異性的結(jié)合會超過抗體的特異性，所以會造成這種現(xiàn)象，在細胞表面時如圖所示。這個時候推薦使用其他陰性對照，如空白對照等。