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上海勁馬生物溫馨提示：以上標(biāo)本置4℃保存應(yīng)小于1周，-20℃或-80℃均應(yīng)密封保存，-20℃不應(yīng)超過(guò)1個(gè)月，-80℃不應(yīng)超過(guò)2個(gè)月；標(biāo)本溶血會(huì)影響zui后檢測(cè)結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)。對(duì)于每一項(xiàng)IHC/ICC研究，組織和細(xì)胞樣本的制備都不可掉以輕心。為了方便孵育，整個(gè)組織必須被切成超?。?-10 μm）的切片，或切成小塊用于整體免疫組化（whole mount IHC）。對(duì)于ICC實(shí)驗(yàn)，在開(kāi)始染色步驟之前，細(xì)胞必須附著在顯微鏡載玻片或蓋玻片上。樣本制備也與固定方法密切相關(guān)，而固定方法又會(huì)受到檢測(cè)技術(shù)（熒光 vs 顯色）的影響。
在大部分情況下，某個(gè)實(shí)驗(yàn)變量將決定樣本制備的zui合適方法。例如，浸潤(rùn)固定在甲醛中的組織必須石蠟包埋，并利用切片機(jī)切片?；蛘撸瑸榱藱z測(cè)磷酸化依賴的表位，組織可能需要快速冷凍，因此在醇類固定之后就需要一個(gè)低溫箱來(lái)進(jìn)行樣本切片。
石蠟包埋的組織
石蠟包埋為長(zhǎng)期保存組織樣本提供了*選擇。組織在用石蠟包埋之前必須固定。固定可通過(guò)灌注或解剖后立即浸潤(rùn)來(lái)實(shí)現(xiàn)，一般需要4-24小時(shí)。不建議固定組織24小時(shí)以上，因?yàn)楣潭ㄟ^(guò)度可能導(dǎo)致抗原的遮蔽。如有必要，組織在固定后可轉(zhuǎn)移至酒精中，直至包埋過(guò)程。
因?yàn)槭炁c水是不混溶的，所以組織在加入熔化的固體石蠟前必須脫水。脫水是通過(guò)浸潤(rùn)在濃度遞增的酒精中而實(shí)現(xiàn)的。這種方法逐步改變疏水性，讓細(xì)胞傷害zui小化。脫水之后，組織與二甲苯共同孵育，以去除任何殘留的酒精。石蠟一般加熱到60?C進(jìn)行包埋，隨后過(guò)夜硬化。之后利用切片機(jī)用鋒利的刀片將組織切成超薄的切片。切片在顯微鏡載玻片上干燥，并長(zhǎng)時(shí)間室溫儲(chǔ)存。組織切片在開(kāi)始IHC/ICC步驟之前必須再水化。石蠟是組織包埋的*也是zui常用的物質(zhì)。不過(guò)，組織也可包埋在塑料中，凝固得更硬，并切成更薄的組織切片（1.5μm vs 5 μm）。 
冰凍組織
冰凍組織樣本的好處之一是省去了石蠟包埋組織zui初所需的固定步驟。在檢測(cè)翻譯后修飾如磷酸化時(shí)，快速冷凍特別有益。冰凍組織的制備可將組織浸潤(rùn)在液氮或異戊烷中，或埋在干冰里。對(duì)于冰凍組織，在冷凍和切片之后進(jìn)行一個(gè)短時(shí)間的固定。冰凍組織切片zui常用醇類固定，這避免了修復(fù)甲醛交聯(lián)所遮蔽的表位的需要。冰凍組織在低溫箱中切片，切片在-80?C可儲(chǔ)存多達(dá)1年。
冰凍組織切片的處理時(shí)間比石蠟包埋切片要短一些。不過(guò)，冷凍對(duì)于組織的長(zhǎng)期保存是不夠的，且細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成可能會(huì)負(fù)面影響亞細(xì)胞的細(xì)節(jié)。此外，冰凍切片通常比石蠟切片厚。這可能導(dǎo)致較低的顯微鏡分辨率以及差的組織形態(tài)學(xué)圖像。因?yàn)楸鶅銮衅ǔ１Ａ裘傅幕钚裕苑忾]可能影響IHC檢測(cè)的內(nèi)源酶的活性也是特別重要的。
IHC樣本制備的比較
 組織
 石蠟包埋冰凍
固定包埋前切片后
切片切片機(jī)低溫箱 
儲(chǔ)存在室溫下多年在-80?C一年
優(yōu)勢(shì)保留組織形態(tài)保留酶和抗原的功能 
劣勢(shì)固定過(guò)度可能遮蔽表位冰晶的形成可能負(fù)面影響組織結(jié)構(gòu)
細(xì)胞樣本
在開(kāi)展ICC研究時(shí)，首先必須將細(xì)胞附著在固體支持物上，如顯微鏡載玻片或蓋玻片。這對(duì)于貼壁細(xì)胞很簡(jiǎn)單，它們可直接放置在6孔或24孔板底部的無(wú)菌蓋玻片上生長(zhǎng)。將蓋玻片預(yù)包被一層帶電荷的聚合物（如多聚賴氨酸）和/或細(xì)胞外基質(zhì)蛋白（如層粘連蛋白、纖維粘連蛋白或膠原），可增強(qiáng)細(xì)胞附著。染色過(guò)程的所有步驟可在微孔板內(nèi)的蓋玻片上開(kāi)展，向每個(gè)孔中加入適當(dāng)?shù)娜芤翰⒁谱呷芤骸腋〖?xì)胞可通過(guò)Cytospin® 離心或與包被多聚賴氨酸的玻片孵育10分鐘而附著在玻片上