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可能原因有①一抗和二抗不匹配②沒有足夠的一抗和二抗來結(jié)合目標(biāo)蛋白③封閉劑與一抗或二抗有交叉反應(yīng)④一抗不識別待檢物種蛋白⑤抗原量不足⑥組織中目的蛋白含量低⑦轉(zhuǎn)膜不充分⑧洗膜過度⑨過度封閉使目標(biāo)蛋白不能顯色⑩一抗失效 ?二抗受疊氮化納抑制?檢測試劑過期或底物失活。
相應(yīng)的處理辦法分別是①保證二抗與一抗宿主物種相同(如一抗來自小鼠，二抗須為抗小鼠抗體)②使用高濃度抗體，4℃延長孵育時間(如過夜);③使用溫和的去污劑如吐溫-20或更換封閉劑(脫脂奶粉、BSA、明膠等);④參照況明書，比對免疫原序列和蛋白序列以確?？贵w和目的蛋白會發(fā)生反應(yīng)，設(shè)置陽性對照⑤保證每條泳道蛋白上樣量不低于20-30μg，使用蛋白酶抑制劑并設(shè)置陽性對照⑥ 濃縮樣本使信號zui大化⑦使用可逆染色劑如立春紅S檢測轉(zhuǎn)膜結(jié)果，檢查轉(zhuǎn)膜操作是否正確⑧適度洗膜⑨預(yù)實驗選擇合適的封閉劑或縮短封閉時間⑩使用新鮮抗體，重復(fù)使用有效濃度會降低?避免疊氮化餉和H盯標(biāo)記抗體起使用?使用新鮮底物。
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