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由于在流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)過程中，熒光抗體對(duì)單細(xì)胞懸液的標(biāo)記效果直接影響實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)質(zhì)量。因此，需要考慮各種影響流式抗體品質(zhì)及檢測效果的因素，例如抗體特異性、熒光素信號(hào)強(qiáng)弱、熒光素標(biāo)記方式、同型對(duì)照等。

流式抗體的選擇：

1 流式抗體本身也是抗體，所以選擇流式抗體一定要滿足抗體選擇zui基本的條件：目標(biāo)蛋白特異性，反應(yīng)種屬以及應(yīng)用實(shí)驗(yàn)。

2 流式抗體熒光標(biāo)記的方式包括直接標(biāo)記和間接標(biāo)記兩種。在流式實(shí)驗(yàn)過程中，盡量減少實(shí)驗(yàn)工序和過程，以保證實(shí)驗(yàn)的真實(shí)和準(zhǔn)確性。因此在條件允許的范圍內(nèi)，建議盡量用直接標(biāo)記的抗體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)而不去做間接標(biāo)記。

3 流式抗體熒光標(biāo)記的選擇：如果實(shí)驗(yàn)中檢測單一指標(biāo)：不同熒光標(biāo)記在不同的儀器上強(qiáng)度不同。FACS Calibur儀器為例：PE ＞APC ＞PE-Cy5 ＞PerCP ＞FITC ＞PerCP-Cy5.5，通常來說，PEzui強(qiáng)，適用于弱表達(dá)抗原。FITC強(qiáng)度較弱，適用于強(qiáng)表達(dá)抗原，使用范圍比較廣。用戶需根據(jù)檢測的目標(biāo)蛋白進(jìn)行具體選擇。如果同時(shí)檢測多個(gè)指標(biāo)：確認(rèn)流式細(xì)胞儀能檢測多少個(gè)通道：流式抗體每個(gè)通道只能選擇1種熒光素。各個(gè)通道之間的熒光素可以隨意搭配。如：實(shí)驗(yàn)者同時(shí)檢測三個(gè)指標(biāo)，可以在圖1中綠色、黃色和紅色三個(gè)通道中各選一個(gè)適當(dāng)?shù)臒晒馑貥?biāo)記，F(xiàn)ITC、PE和PE-cy5。切忌所有指標(biāo)選擇同一個(gè)通道的熒光標(biāo)記，以防止熒光的重疊和相互干擾，影響zui后結(jié)果。因此，流式細(xì)胞儀的通道越多，同一份樣本能同時(shí)做的表面/胞內(nèi)標(biāo)志就越多。常用熒光標(biāo)記包括FITC, PE, PEcy5, PEcy5.5, APC等。

常見熒光素波長分布示意圖

同型對(duì)照的選擇：

流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和其他抗體相關(guān)實(shí)驗(yàn)有點(diǎn)不同的就是需要選擇同型對(duì)照。同型對(duì)照，是用于消除由于抗體非特異性結(jié)合到細(xì)胞表面而產(chǎn)生的背景染色，相當(dāng)于實(shí)驗(yàn)的陰性對(duì)照。同型對(duì)照選擇與標(biāo)記抗體同種屬來源，同亞型，同熒光標(biāo)記的抗體。比如：抗人的CD3的PE標(biāo)記的抗體，小鼠的IgG2a。同型對(duì)照選擇PE標(biāo)記的小鼠的IgG2a。

流式抗體使用注意事項(xiàng)：

1、建議實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的數(shù)量和抗體的比例要適當(dāng)。細(xì)胞過量或抗體過量都可能使實(shí)驗(yàn)結(jié)果受影響，因此需要優(yōu)化試驗(yàn)條件。注：不同的流式技術(shù)對(duì)抗體的需求量有較大差異，例如傳統(tǒng)流式細(xì)胞術(shù) （采用鞘液流系統(tǒng)）需要1×106個(gè)細(xì)胞為起始上樣量，抗體用量為10μl，而微流式細(xì)胞術(shù) 則只需5×105個(gè)細(xì)胞，抗體用量減少到5μl。

2、直標(biāo)的流式抗體應(yīng)該4℃避光保存，不要冷凍。

3、盡量選擇經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的流式抗體，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果。