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神經(jīng)干細胞與血管性癡呆大鼠海馬能神經(jīng)元變化的相關(guān)性
孫玉華，耿利嬌，趙靜雅，賀維亞，李保平(河南大學(xué)淮河醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南省開封市 475001) 

文章亮點：
1 有研究顯示，神經(jīng)干細胞移植可以增加血管性癡呆模型大鼠腦內(nèi)能神經(jīng)細胞，其機制可能為外源性神經(jīng)干細胞在移植區(qū)增殖、分化，并可能促進了內(nèi)源性神經(jīng)干細胞的分化、遷移，改善了大鼠腦內(nèi)局部的微環(huán)境。
2 神經(jīng)干細胞移植后乙酰轉(zhuǎn)移酶陽性細胞增多，從而有效促進能神經(jīng)元分化及生長，乙酰增多，使大鼠海馬區(qū)神經(jīng)功能恢復(fù)，并促進大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的有效改善，其具體機制目前尚缺乏有利證據(jù)支持。
關(guān)鍵詞：
干細胞；移植；癡呆；血管性；海馬能神經(jīng)元；神經(jīng)干細胞；干細胞移植；乙酰轉(zhuǎn)移酶；學(xué)習(xí)記憶能力；乙酰；SD 大鼠
主題詞：
神經(jīng)干細胞；癡呆, 血管性；神經(jīng)元；組織工程
摘要
背景：血管性癡呆患者存在額葉皮質(zhì)及海馬能神經(jīng)元受損，可能是導(dǎo)致患者認(rèn)知功能受損的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。
目的：探討神經(jīng)干細胞與血管性癡呆大鼠海馬能神經(jīng)元變化的相關(guān)性。
方法：納入 90 只 SD 大鼠，隨機均分為 3 組，其中假手術(shù)組僅分離頸總動脈，模型組和神經(jīng)干細胞移植組采用兩血管結(jié)扎法建立血管性癡呆動物模型，神經(jīng)干細胞移植組在建立血管性癡呆動物模型之后向大鼠海馬CA1 區(qū)注射 5 μL 神經(jīng)干細胞，另外兩組按照同樣的操作注射相同劑量的生理鹽水。移植后第 3，7，14，30，60 天，分別處死各組 6 只大鼠，采用 S-P 免疫組化法檢測各組腦實質(zhì) BrdU 陽性細胞和 ChAT 陽性細胞分布情況，利用 Morris 水迷宮系統(tǒng)檢測大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。
結(jié)果與結(jié)論：BrdU 陽性細胞主要分布在大腦皮質(zhì)區(qū)以及海馬區(qū)，尤其是血管周圍。在基底核和丘腦以及室管膜區(qū)，可觀察到少量 BrdU 陽性細胞存在。隨著時間的推移，BrdU 陽性細胞數(shù)目不斷下降，到移植后 60 d，僅存在少量 BrdU 陽性細胞存活。移植后不同時間模型組和神經(jīng)干細胞移植組的 ChAT 陽性細胞數(shù)均顯著大于假手術(shù)組(P < 0.05)；模型組 ChAT 陽性細胞數(shù)顯著低于神經(jīng)干細胞移植組(P < 0.05)。模型組尋找平臺時間顯著長于假手術(shù)組，穿越平臺次數(shù)顯著少于假手術(shù)組(P < 0.05)；神經(jīng)干細胞移植組的尋找平臺時間顯著短于模型組，穿越平臺次數(shù)顯著大于模型組(P < 0.05)。結(jié)果表明神經(jīng)干細胞可以在大鼠腦內(nèi)存活并發(fā)生遷移，顯著改善血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，相關(guān)機制可能與海馬能神經(jīng)元分化和生長有關(guān)。

引言 Introduction
隨著社會發(fā)展和人口的老齡化，各種腦血管病的發(fā)病率呈現(xiàn)出不斷上升的趨勢[1]。血管性癡呆是一種由腦血管疾病所致的認(rèn)知功能障礙綜合征，嚴(yán)重影響患者和家屬的生活質(zhì)量，也給整個社會以及家庭帶來了沉重的精神和經(jīng)濟負擔(dān)[2]。血管性癡呆的病情發(fā)展十分迅速，在病史中有反復(fù)多次的腦卒中發(fā)作，腦卒中每發(fā)作1次癡呆癥狀加重1次[3]。按照病理形態(tài)可將血管性癡呆分為彌漫性缺血型、多發(fā)性梗死型和重要部位的梗死型，如海馬回、丘腦及額葉的梗死。血管性癡呆會導(dǎo)致乙酰合成量和乙酰轉(zhuǎn)移酶活性顯著下降[4]。1992年，國外學(xué)者Reynolds等[5]從成年大鼠紋狀體和海馬中分離出一種特殊的細胞群，這類細胞群能自我更新并具有多向分化潛能。隨著干細胞理論和相關(guān)研究的不斷進展，確定了中樞神經(jīng)系統(tǒng)存在神經(jīng)干細胞。大量研究發(fā)現(xiàn)，各種原因?qū)е律窠?jīng)細胞損傷后，可以利用一定的方式進行修復(fù)，以達到治療疾病的目的，其中神經(jīng)干細胞移植治療是一個重要的途徑[6-7]。本研究建立血管性癡呆動物模型并進行神經(jīng)干細胞移植，通過觀察腦實質(zhì)BrdU陽性細胞和ChAT陽性細胞分布情況以及大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，探討神經(jīng)干細胞與血管性癡呆大鼠海馬能神經(jīng)元變化的相關(guān)性。
1 材料和方法 Materials and methods 
1.1 設(shè)計 隨機對照動物實驗。
1.2 時間及地點 實驗于2015年4至7月在河南大學(xué)淮河醫(yī)院完成。
1.3 實驗動物和材料 90只成年雌性SD大鼠，體質(zhì)量180-220 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，使用許可證號：scxk(滬)2015-0015。5只新生1-3 d SD大鼠，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司。實驗過程中對動物處置符合動物倫理學(xué)要求。
1.4 實驗方法
1.4.1 動物分組與血管性癡呆大鼠模型制作 將90只成年SD大鼠隨機分為3組，其中模型組30只，神經(jīng)干細胞移植組30只，假手術(shù)組30只。模型組和神經(jīng)干細胞移植組均采用兩血管結(jié)扎法建立血管性癡呆動物模型。大鼠常規(guī)禁食 12 h、禁水4 h，10%腹腔注射麻醉后，于頸前部皮膚正中做切口，鈍性分離雙側(cè)頸總動脈，利用“1”號線對兩側(cè)頸總動脈進行結(jié)扎，結(jié)扎后常規(guī)消毒，縫合皮膚。假手術(shù)組實施相同的分離操作，僅分離雙側(cè)頸總動脈，不結(jié)扎。

神經(jīng)干細胞移植后血管性癡呆大鼠海馬能神經(jīng)元變化的實驗所用主要試劑與儀器：

 試劑與儀器 來源 
乙醇 上海樊克生物科技有限公司
上海弘順生物科技有限公司
胎牛血清 北京普博斯生物科技有限公司
移液槍 上海靜融生物科技有限公司
上海勝邁有限公司
磷酸鹽緩沖液 上海瑞楚生物科技有限公司
上海勁馬生物科技有限公司
DMEM培養(yǎng)基 百浩生物科技有限公司(北京) 
兔抗大鼠ChAT多克隆抗體 上海古朵生物科技有限公司
鼠抗人BrdU抗體 上海拜力生物科技有限公司
兔抗鼠熒光二抗 中國北京中杉金橋生物技術(shù)公司
二抗免疫組化試劑盒(SP試劑盒) 北京博奧森生物技術(shù)有限公司
DAB顯色試劑盒 武漢博士德生物工程有限公司
流式細胞儀 金華市科迪儀器設(shè)備有限公司
離心機 上海明茲精密儀器有限公司

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